Mikroorganizmy, występujące w środowisku naturalnym, rzadko spotykane są w postaci rozproszonych, pojedynczych komórek, czyli planktonu [Donlan], raczej wykazują tendencję tworzenia skupisk zwanych biofilmem, błoną biologiczną czy też biowarstwą. Skupiska takie w postaci hydrożelu najczęściej tworzą się na powierzchniach stałych lub powierzchniach komórek innych organizmów [Costerton 1995, 1996]. Biofilm (z ang. film - warstwa), czyli biowarstwa to wielokomórkowy, trójwymiarowy twór złożony z mikroorganizmów jednego lub wielu gatunków czy rodzajów, wykazujących zdolność adhezji do wilgotnych powierzchni stałych oraz do siebie nawzajem [Chandra]. W jego skład mogą wchodzić oprócz bakterii również glony, grzyby i pierwotniaki. Wiele mikroorganizmów posiada zdolność do tworzenia biofilmu, są to drobnoustroje, zarówno autotrofy, jak i heterotrofy, wśród nich znajdują się saprofity oraz patogeny [Currie].

Rys. 1. Zróżnicowanie aktywności metabolicznej w obrębie biofilmu [http://bioinfo./bioinfo.mol.uj.edu.pl/articles/ Buchala05]

Struktura biofilmu
    Liczne komórki mikroorganizmów tworzące biofilm otoczone są warstwą śluzu (pozakomórkowa substancja polimeryczna (EPS), w skład którego wchodzą polisacharydy, białka, kwasy nukleinowe, surfaktanty, fosfolipidy oraz woda), który ułatwia powstawanie złożonych struktur [Monds]. Formowanie się takich struktur biofilmu ma na celu ochronę mikroorganizmów (tworzących biofilm) przed degradacyjną działalnością czynników środowiskowych, w tym także na działanie antybiotyków i środków dezynfekcyjnych. Wysoka oporność komórek bakteryjnych wchodzących w skład biofilmu na działanie substancji bakteriobójczych zależy w dużym stopniu od rodzaju powierzchni, na której powstał dany biofilm. Stwierdzono w badaniach [Krysiński], że biofilm Listeria monocytogenes jest łatwiej usuwany z powierzchni stalowych niż z powierzchni tworzyw sztucznych, takich jak polistyren czy poliuretan.

Proces tworzenia
    Proces tworzenia się biofilmu jest wielostopniowy, uwarunkowany właściwościami tworzących go drobnoustrojów oraz budową i właściwościami zajmowanych materiałów czy też kolonizowanego gospodarza, jakim może być każdy żywy organizm. Może on być jednolub wielowarstwowy, zbudowany z jednego lub wielu gatunków mikroorganizmów. Jego budowa uzależniona jest od takich czynników, jak: warunki hydrodynamiczne, ruchliwość bakterii, zawartość substancji odżywczych, komunikacja międzykomórkowa, zawartość białek czy egzopolisacharydów. Postać dojrzała biofilmu składa się z dużej ilości mikrokolonii, które tworzą specyficzne zgrupowania [Flemming].
    Formowanie biofilmu inicjują tylko niektóre bakterie, które wiążą się z kolonizowaną powierzchnią odwracalnymi wiązaniami Van der Waalsa, pozostają stale w kontakcie z wodą. W chwili, gdy natychmiast nie zostaną usunięte, przytwierdzają się na stałe dzięki elementom komórki umożliwiającym adhezję. Pierwsze przytwierdzone do powierzchni komórki pozwalają na dołączanie kolejnych dzięki różnorakim możliwościom wzajemnego wiązania, w ten sposób tworzy się podstawa matrycy EPS, która nadaje biofilmowi określoną strukturę. Proces tworzenia biofilmu przebiega w czterech stadiach (rys. 2):
1. odwracalna adhezja do powierzchni stałej, faza wstępna,
2. nieodwracalna adhezja do powierzchni stałej, powstawanie matrycy EPS,
3. kolonizacja matrycy, powstawanie mikrokolonii, wzrost bakterii i powiększenie objętości mikrokolonii,
4. łączenie się mikrokolonii, powstawanie i dojrzewanie biofilmu.
    Cały cykl życia biofilmu zamyka piąte stadium, obumieranie komórek oraz dyspersja pojedynczych komórek do planktonu i powstawanie nowych mikrokolonii [Kołwzan].

Typy budowy biofilmu
    Pod względem morfologicznym wyróżnia się trzy podstawowe typy budowy biofilmu: płaski, kolumnowy i tzw. model grzyba.
mikroorganizmom tworzącym biofi lm substancji odżywczych    Pierwszy z nich ma postać płaskich, dwuwymiarowych i homogennych pasków rozciągniętych w cienkiej warstwie wzdłuż powierzchni przylegania, powstaje w środowisku, w którym występują duże siły ścinania (np. wartki strumień wody, płytka nazębna). Drugi to układ kolumnowy otoczony zewnątrzkomórkowymi związkami polimerów. Nad mikroorganizmami bezpośrednio związanymi z powierzchnią adhezji tworzą się „kolumny” tworzone przez kolejne bakterie. Układ taki nazwany został „modelem heterogennej mozaiki”, taki układ najczęściej wytwarzają bakterie patogenne, m.in. Escherichia coli czy Pseudomonas aeruginosa. Najbardziej złożonym modelem biofilmu jest tzw. „model grzyba”. Mikroorganizmy tworzą zbiorowiska, które swoim kształtem przypominają grzyb. Pomiędzy poszczególnymi strukturami znajdują się kanały, które są odpowiedzialne za dostarczenie i tlenu oraz wydalanie produktów przemiany materii. Jest to łącze pomiędzy wnętrzem biofilmu a środowiskiem, w którym się znajduje [Rodziwicz].

Rys. 2. Schemat procesu tworzenia dojrzałej postaci biofilmu [Kołwaz]

Jakie problemy pociągają za sobą biofilmy?
    Powstające biofilmy utrudniają w znacznym stopniu utrzymanie higieny w szpitalach, sanatoriach, w zakładach żywienia zbiorowego, szkołach, przedszkolach, hotelach, basenach, w zakładach przemysłu spożywczego i kosmetycznego, a także w warunkach domowych. Pojawienie się biofilmu w sposób przypadkowy, niekontrolowany o patogennym składzie powoduje negatywne skutki zarówno dla ludzi, a zwłaszcza pacjentów w szpitalach, jak i dla środowiska. Dodatkowo biofi lm, tworzący się na powierzchni różnych urządzeń, powoduje straty w wyposażeniu, niszczy wytworzone produkty oraz może przyczyniać się do większego zużycia energii elektrycznej. Powstawanie biofilmu jest przedmiotem zainteresowania nie tylko przemysłu spożywczego. Większość zakładów boryka się z problemem jego powstawania w systemach przesyłu wody, systemach chłodniczych czy wymiennikach ciepła. Znaczącym problemem staje się coraz większa liczba szczepów wielolekoopornych, a co za tym idzie wywoływanych przez nie zakażeń wewnątrzszpitalnych, w których przebiegu dochodzi często do zjawiska wytwarzania biofilmu bakteryjnego.
    Mikroorganizmy, które zdolne są do tworzenia biofilmu, stanowią poważny problem w przemyśle spożywczym. Mogą one zasiedlać produkty spożywcze, a także powierzchnie robocze służące do ich przygotowywania. Skażone produkty pochodzenia zwierzęcego czy roślinnego mogą stać się przyczyną poważnych dolegliwości u ludzi [Shi]. Bakterie z rodzaju Yersinia, Salmonella, Escherichia, Campylobacter, Staphylococcus, Bacillus oraz pałeczki z rodzaju Listeria wywołują różnego rodzaju schorzenia [Kołwzan]. Coraz częściej źródłem infekcji pałeczkami z rodzaju Listeria stają się produkty spożywcze. Patogeny te wykazują powinowactwo do komórek centralnego układu nerwowego człowieka i zwierząt. Często zdarza się, że infekcje mają ostry przebieg doprowadzający do śmierci. Mikroorganizmy te namnażają się na powierzchni przedmiotów oraz w przewodzie pokarmowym w postaci mikrokolonii otoczonych warstwą glikokaliksu. Pojedyncze kolonie łączą się ze sobą, tworząc biofilm, który zwiększa oporność pałeczek Listeria na antybiotyki, oddziaływanie immunoglobulin oraz stanowi on ochronę przed fagocytozą, analogicznie jak u innych gatunków bakterii [Furowicz]. Uważa się również, że mięso wieprzowe jest głównym rezerwuarem bakterii z rodzaju Yersinia i stanowi źródło zakażenia człowieka. Zakażenie pałeczkami Y. pseudotuberculosis u człowieka może mieć postać zatrucia pokarmowego, zapalenia jelit, bakteriemii czy posocznicy [Furowicz].
    W przemyśle spożywczym pokrywanie przez biofilm powierzchni roboczych przyczyniać się może do skażenia żywności drobnoustrojami, które powodują jej zepsucie oraz drobnoustrojami chorobotwórczymi. Biofilmy bakteryjne skutecznie kolonizują powierzchnie użytkowe ze stali nierdzewnej, szkła czy teflonu [Czaczyk]. Przeprowadzone badania wskazują na bezpośredni wpływ rodzaju badanego drobnoustroju oraz dostępności składników odżywczych na szybkość powstawania biofilmu bakteryjnego [Kołwzan]. Biofilm na wewnętrznych ściankach rur prowadzi do zatorów i korozji, bakterie beztlenowe redukujące siarczany do siarkowodoru przyczyniają się do perforacji materiału, z którego zbudowane są rurociągi. Bakterie tlenowe natomiast są odpowiedzialne za korozję oksydacyjną metali. Zjawiska te są przyczyną poważnych strat w przemyśle spożywczym, można je podzielić na straty ekonomiczne i w samym produkcie.

Jak zapobiec powstaniu biofilmu?
    Ustrukturyzowana organizacja mikroorganizmów w matrycy EPS, przywierająca do powierzchni, chroniona i powiększająca się, tworzy się bez względu na warunki temperatury, pH, zabrudzenia, dotyczy także wszystkich powierzchni, a jednocześnie tworzy odporność biofilmu na procesy mycia, dezynfekcji oraz zjawisko biokorozji. Zwarta jego struktura jest bardzo trudna do usunięcia, dlatego też mycie i dezynfekcja są ważnymi czynnikami, mającymi na celu zapobieganie akumulacji materii mikrobiologicznej. Konwencjonalne metody dezaktywacji drobnoustrojów (użycie antybiotyków czy dezynfekcja chlorem) stają się coraz mniej efektywne z uwagi na rozwijanie przez nie funkcji adaptacyjnej, przystosowawczej w stosunku do środków dezynfekcyjnych – antyseptycznych. Sprowadza się to głównie do tworzenia ścisłych, wielowarstwowych struktur uformowanych z komórek drobnoustrojów, otoczonych śluzem oraz innymi produktami metabolizmu.
    Do rozwoju takich zachowań wśród drobnoustrojów doprowadza stosowanie na bardzo szeroką skalę środków antyseptycznych, między innymi alkoholi, środków utleniających, środków alkilujących czy też środków powierzchniowo czynnych oraz stosowanie bardzo wysokich dawek. Prowadzi to do niekorzystnego wpływu na środowisko. W celu uniknięcia rozwoju tego typu przystosowań wśród drobnoustrojów ważnym jest, aby stosować różne preparaty antyseptyczne i dezynfekcyjne, co spowoduje, że drobnoustroje nie zdołają przystosować się do danego środka dezynfekcyjnego.

Metody, które pozwalają na zapobieganie powstawaniu i rozwojowi biofilmu, to:
• unikanie powstawania osadów mineralnych (okresowe korzystanie z preparatów kwaśnych),
• ograniczanie ognisk korozji,
• kontrolowanie parametrów chemicznych i mikrobiologicznych wody,
• ograniczanie do minimum na terenie zakładu powierzchni porowatych i nasiąkliwych,
• prawidłowe prowadzenie procesów mycia oraz dezynfekcji (powinny być dokonywane bezpośrednio po zakończonej produkcji),
• odpowiednio dobrane parametry mycia i dezynfekcji (środek chemiczny, czas, stężenie.
    W obliczu ekspansji szczepów antybiotykoopornych, opornych na środki antyseptyczne i dezynfekcyjne staje się konieczne opracowanie nowych oraz udoskonalanie starych strategii, mających na celu profilaktykę i skuteczne zwalczania zakażeń bakteryjnych. Metody te powinny być oparte przede wszystkim na lepszym zrozumieniu procesu tworzenia się biofilmu w celu wczesnego i skuteczniejszego jego zwalczania. Jednym ze sposobów likwidacji biofilmu jest zastosowanie metody kombinowanej, czyli wstępne mechaniczne rozbicie struktury żelowej, a następnie dezaktywacja za pomocą metod chemicznych bądź termicznych mikroorganizmów niechronionych już przez zbity żel.
    Pewnym sposobem likwidacji biofilmu jest zastosowanie nowoczesnych materiałów do budowy instalacji wodnych czy też instalacji innych płynów technologicznych, np. powłok nanopolimerowych. Powłoki takie zastosowane w rurociągach uniemożliwiają osadzanie się biofilmu na powierzchni rur i innych urządzeń.
    Zostało udowodnione, że dwutlenek chloru usuwa biofilm z systemów wodnych i zapobiega jego powstawaniu, jeśli środek ten jest dozowany w niskim stężeniu w sposób ciągły [Shi].
    Dobór właściwego środka myjącego (dezynfekcyjnego) – zależnie od rodzaju powierzchni urządzeń i rodzaju zabrudzenia, ważne jest zastosowanie optymalnego stężenia, ponieważ nie ma powodu, by stosować stężenia większe od optymalnych (nie daje to poprawy skuteczności, a zwiększa koszty). Roztwór środka myjącego może być stosowany przez pewien określony czas, jednak na skutek przystosowania się mikroorganizmów do danego rodzaju środka myjącego po pewnym czasie traci on swoją aktywność. Ważna jest również temperatura roztworu myjącego, jest ona uzależniona od rodzaju powierzchni i trwałości środka myjącego w danej temperaturze. Wzrost temperatury o 10^oC przyspiesza prawie dwukrotnie działanie użytych środków. Czas działania środka myjącego jest funkcją stężenia i temperatury, przy silnym zabrudzeniu konieczny jest etap namaczania. Efektywność środków dezynfekcyjnych jest również zależna od zastosowanej metody mycia (mycie ręczne, mechaniczne).

Biofilm na wewnętrznych ściankach rur prowadzi do zatorów i korozji.

Literatura
1. Donlan R.M.: Biofilms: Microbial life on surfaces. Emerging Infectioua Diseases 2002, 8, 136-151.
2. Costerton J.W., Lewandowski Z., Debeer D., Caldwell D.E., Korber D.R., James G.: Biofilms, the customized microniche. Journal of Bacteriology 1994, 176, 2137-2142.
3. Costerton J.W., Lewandowski Z., Caldwell D.E., Korber D.R., Lappin-Scott H.M.: Microbial biofilms. Annual Review of Microbiology 1995, 49, 711-745.
4. Chandra J., Zhou G., Channoum M.A.: Fungal biofilms and actimycotics. Current Drug Targets 2005, 8, 887–894.
5. Currie C.R: A community of ants, fungi, and bacteria: A multilateral approach to studying symbiosis. Annual Review of Microbiology 2001, 55, 357-380.
6. Czaczyk K.: Czynniki warunkujące adhezję drobnoustrojów do powierzchni abiotycznych. Postępy Mikrobiologii 2004, 43 (3), 267-283.
7. Kałwzan B.: Analiza zjawiska biofilmu – warunki powstawania i funkcjonowania Ochrona Środowiska 2011, 33 (4),
8. Monds R.D., O´Tool G.A.: The developmental model of microbial biofilms: Ten years of a paradigm up for review. Trends in Microbiology 2009, 17 (2), 73-87.
9. Shi X., Zhu X.: Biofilm formation and food safety in food industries. Trends in Food Science & Technology 2009, 20 (9), 407-413.
10. Flemming H.-C., Wingender J.: The biofilm matrix. Nature Reviews Microbiology 2010, 8, 623–633.
11. Krysiński E.P., Brown L.J., Marchisello T.J: Effect of claners and sanitizers on Listeria monocytogenes attached to product contact surfaces. Journal of Food Protection 1999, 55, 246-251.
12. Strużycka I.: Biofilm – współczesne spojrzenie na etiologię próchnicy. Dental Forum 2010, Vol. XXXVIII, nr 1, 73-79.

Autor: dr inż. Agnieszka Nawirska-Olszańska, Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu

Artykuł został opublikowany w magazynie "Agro Przemysł" nr 1/2012

Źródło fot.: www.sxc.hu