Metody wykrywania drobnoustrojów patogennych są bardzo zróżnicowane, biorąc pod uwagę nie tylko pożywki hodowlane, ale również warunki inkubacji oraz metody identyfikacji. W rutynowej analizie mikrobiologicznej niemożliwe jest więc zbadanie wody w kierunku wszystkich organizmów chorobotwórczych, zatem konieczne stało się wytypowanie szczególnych bakterii, tzw. wskaźników zanieczyszczenia, których obecność w wodzie świadczyłaby o jej fekalnym zanieczyszczeniu, a tym samym możliwości występowania drobnoustrojów chorobotwórczych. Stałą mikroflorę jelitową zdrowego człowieka stanowią m.in. pałeczki Escherichia coli. Zostały więc one wytypowane jako wskaźnik sanitarny w ocenie mikrobiologicznej żywności, wody oraz środowiska.

Bakterie grupy coli
    Liczną grupą bakterii należących do rodziny Enterobacteriaceae są bakterie grupy coli. Większość definicji opisujących bakterie z grupy coli oparta jest o ich wspólne cechy morfologiczne i biochemiczne. W normach ISO 9308, opisujących referencyjne metody ich wykrywania, bakterie grupy coli opisane są jako: względnie beztlenowe, Gram-ujemne, nieprzetrwalnikujące pałeczki produkujące gaz z laktozy w pożywce z zielenią brylantową oraz solami żółci w czasie 48 godzin w temperaturze 35 ± 0,5^oC lub 37 ± 0,5^oC (ISO 9308-2:1990), lub względnie beztlenowe, Gram-ujemne, nietworzące przetrwalników pałeczki, które tworzą kolonie na selektywnym podłożu agarowym z laktozą i produkują kwas (i aldehyd) w ciągu 24 godzin w temperaturze 35 ± 0,5^oC lub 37 ± 0,5^oC (ISO 9308-1:1990). Definicja bakterii grupy coli została rozszerzona dzięki uwzględnieniu innej istotnej cechy biochemicznej: obecności enzymu oksydazy cytochromowej. Test na obecność tego enzymu jest obecnie stosowany w badaniach potwierdzających, aby wyeliminować wyniki fałszywie dodatnie, spowodowane obecnością niektórych bakterii Gram-ujemnych, głównie z rodzajów Aeromonas lub Pseudomonas, zdolnych do fermentacji laktozy. W skład bakterii grupy coli wchodzą pałeczki należące do rodzajów: Escherichia, Klebsiella, Enterobacter i Citrobacter, które spełniają warunki wspomnianych definicji. W rutynowej analizie wody stosuje się określenia: „bakterie grupy coli” oraz „bakterie grupy coli typu fekalnego”. Bakterie grupy coli typu fekalnego, zwane także termotolerancyjnymi, są zdolne do wzrostu w wyższej temperaturze, wynoszącej nawet 44^oC. Typowym przedstawicielem tej grupy jest Escherichia coli, która produkuje indol z tryptofanu w temperaturze 44 ± 0,5^oC, daje pozytywny wynik z czerwienią metylową, ale nie jest zdolna do produkcji acetylometylokarbinolu i nie wykorzystuje cytrynianu jako jedynego źródła węgla.

Użyteczny test
    Do niedawna wszystkie bakterie, które fermentowały laktozę na etapie badań wstępnych, dawały negatywny wynik testu na obecność oksydazy i wytwarzały indol z tryptofanu w 44^oC w badaniach potwierdzających uznawano za E. coli. Jednak ostatnio wyniki badań naukowych dowiodły, że istnieją inne bakterie, które mogą spełniać powyższe kryteria. Należą do nich głównie pałeczki Klebsiella oxytoca, często mylone w rutynowych badaniach mikrobiologicznych z E. coli. Z tego powodu włączono w zakres obligatoryjnych badań potwierdzających dodatkowy test na obecność enzymu β-D-glukuronidazy. Choć test ten nie jest całkowicie specyficzny dla wszystkich E. coli, to liczne badania diagnostyczne dowodzą, że jest on bardziej użyteczny niż test na tworzenie indolu z tryptofanu. Badania diagnostyczne obejmujące wiele szczepów izolowanych z różnych środowisk naturalnych wykazały, że ponad 99,5% izolatów E. coli izolowanych z wody wykazywało zdolność do produkcji β-D-glukuronidazy, natomiast nawet do 3% szczepów E. coli nie wytwarzało indolu z tryptofanu.

Rys. 1. Rodzina Enterobacteriaceae oraz bakterie grupy coli

Według norm
    W krajach Unii Europejskiej metodykę do wykrywania pałeczek Escherichia coli w wodzie pitnej określa Dyrektywa 98/83/WE z dnia 3 listopada 1998 r. w sprawie jakości wody przeznaczonej do spożycia przez ludzi (Official Journal L 330, 05/12/1998). Zaleca ona stosowanie aktualnej normy ISO 9308-1: „Jakość wody. Wykrywanie i oznaczanie ilościowe Escherichia coli i bakterii grupy coli. Część 1: Metoda filtracji membranowej”. Norma PN-EN ISO 9308-1:2004/AC:2009 opisuje procedurę wykrywania bakterii grupy coli i E. coli w oparciu o metodę filtracji membranowej (FM) z zastosowaniem podłoża agarowego TTC z laktozą i Tergitolem oraz temperaturą inkubacji 36 ± 2^oC. To podłoże referencyjne jest jednak nieselektywne i zalecane jest tylko dla badania wód o wysokiej jakości mikrobiologicznej. Do wód pitnych, zawierających większy udział mikrofl ory towarzyszącej, która może negatywnie wpływać na jakość i precyzję analizy, można stosować podłoże agarowe Endo i/lub podłoże mFC.
    Opisane metody referencyjne, podobnie jak wszystkie inne metody hodowlane, mają swoje ograniczenia, takie jak: stosunkowo długi czas oczekiwania na wynik badań wstępnych i badań potwierdzających (kilka dni), ingerencja organizmów antagonistycznych oraz niski poziom wykrywania bakterii z grupy coli wolno rosnących lub zestresowanych. W przypadku mikrobiologicznej analizy wody ograniczenia te mogą stanowić istotny problem, gdyż szacuje się, że tylko niewielka część (0,1-15%) ogółu populacji bakterii może być oznaczana standardowymi metodami hodowlanymi, natomiast pozostała, przeważająca część mikroorganizmów w stanie VBNC – żywych, lecz niezdolnych do wzrostu (ang. viable but non-culturable) nie rośnie na pożywkach laboratoryjnych, zwłaszcza na podłożach selektywnych.
    Istnieją inne metody, które mogą być wykorzystywane do wykrywania bakterii grupy coli, jako metody alternatywnej. Dyrektywa europejska 98/83/WE zezwala na korzystanie z procedur innych niż metody normatywne pod warunkiem, że wyniki uzyskane w metodach niereferencyjnych są „co najmniej tak wiarygodne”, jak te uzyskane metodami normatywnymi. Nie jest to precyzyjne sformułowanie, ale norma ISO 17994, służąca dla porównania ilościowych metod mikrobiologicznych, utrzymuje, że metody, które nie różnią się wynikami o więcej niż 5% od metody referencyjnej, mogą zostać uznane za równoważne. Nie jest jednak jasne, czy metodę, która ma większą czułość, co skutkuje ponad 5-procentowym wzrostem wykrywalności organizmu docelowego, należy uznać za „co najmniej tak wiarygodną”. Oczywiście, celem prawodawstwa europejskiego jest standaryzacja metodologii stosowanej przez wszystkie państwa członkowskie, by umożliwić sensowne badania międzylaboratoryjne i porównawcze. Jeśli jednak metoda alternatywna jest bardziej czuła niż normatywna, to powszechne stosowanie tej pierwszej powinno być akceptowane, a nawet zalecane.

Wykryć bakterię
    Stosowanie profili enzymatycznych w celu wykrycia bakterii wskaźnikowych jest atrakcyjną alternatywą dla klasycznych metod hodowlanych, zwłaszcza że reakcje te są stosunkowo szybkie i czułe. Również w przypadku bakterii grupy coli możliwość ich wykrywania za pomocą detekcji specyficznych enzymów była rozważana od wielu lat. Enzym β-D-galaktozydaza katalizuje hydrolizę laktozy do galaktozy i glukozy. Jest on stosowany głównie do rozróżniania bakterii grupy coli wśród pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae. Enzym β-D-glukuronidaza katalizuje hydrolizę β-D-glukopiranozydowych pochodnych w odpowiednie aglikony i kwas D-glukuronowy. Już w latach 70. XX w., badając szeroką grupę bakterii należącą do rodziny Enterobacteriaceae stwierdzono, że aktywność glukuronidazy dotyczy głównie E. coli. Pozytywne reakcje β-D-glukuronidazy obserwowano aż u 94-96% testowanych izolatów tego gatunku. Enzym β-D-glukuronidaza występuje także u innych pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae, głównie u szczepów należących do: Shigella sp. (44÷58%), Salmonella sp. (20÷29%), a także do rodzajów Yersinia i Flavobacterium.
    Oznaczanie aktywności β-D-galaktozydazy i β-Dglukuronidazy do wykrywania i oznaczania odpowiednio bakterii grupy coli i E. coli zastosowano w pożywkach chromogennych i/lub fluorogennych, w których wykrywanie określonego enzymu odbywa się poprzez zmianę koloru i/lub fluorescencji podłoża. Odnotowano, że zastosowanie tych substratów doprowadziło do poprawy odzysku i szybszego wykrycia bakterii wskaźnikowych.
    Metody wykrywania i ilościowego oznaczania bakterii grupy coli mogą być wykonywane w jednym medium, pomijając w ten sposób konieczność czasochłonnej
izolacji pojedynczych kolonii do późniejszego postępowania identyfikacyjnego. W celu wykrycia obecności β-D-glukuronidazy dla detekcji E. coli stosuje się najczęściej substrat chromogenny 5-bromo-4-chloro-3-indolilo- β-D-glukuronid (barwa niebieska), natomiast najczęściej stosowanym substratem fluorogennym jest 4-metyloumbeliferylo-β-D-glukuronid (MUG). Z kolei podłoża zawierające chromogeny: o-nitrofenylo-β-Dgalaktopiranozyd (ONPG) lub 5-bromo-4-chloro-3-indolilo-β-D-galaktopiranozyd (X-Gal) oraz fluorogen 4-metyloumbeliferylo-β-D-galaktopiranozyd (MUGal) są powszechnie wykorzystywane do wykrywania obecności β-D-galaktozydazy (tab. 1).

Tab. 1. Najczęściej wykorzystywane substraty do detekcji bakterii grupy coli

Metoda DST
    Na podstawie enzymatycznych właściwości bakterii grupy coli zostały opracowane metody na bazie technologii zdefiniowanych substratów (DST) z aplikacją zarówno w metodzie rozcieńczeń, inaczej zwanej metodą NPL oraz w metodzie filtracji membranowej (FM). Podczas inkubacji w podłożu chromogennym i/lub fluorogennym substrat jest hydrolizowany, wskazując na obecność poszukiwanych drobnoustrojów.
    W latach 90. ubiegłego wieku zaproponowano łączne wykorzystanie substratu ONPG dla enzymu β-galaktozydazy charakterystycznego dla wszystkich bakterii grupy coli oraz MUG – substratu dla specyficznego wykrywania bakterii E. coli. Zastosowana metoda stanowiła początkowo test jakościowy, którego wynik odczytuje się jako „obecne” lub „nieobecne”. Probówki z bezbarwną na początku pożywką, po dodaniu próbki wody inkubowano w temperaturze 35^oC. Żółty kolor pożywki w probówce, wskazujący na hydrolizę ONPG, przyjęto jako test pozytywny dla bakterii grupy coli. Następnie probówki wykazujące test pozytywny poddawane były naświetlaniu promieniowaniem UV (λ=365), a niebiesko-biała fluorescencja wskazywała na obecność E. coli. Obydwa wykrywane enzymy są tak specyficzne dla poszczególnych bakterii wchodzących w skład grupy coli, że nie muszą być wykonywane żadne dodatkowe testy potwierdzające. Pierwsze eksperymenty wykazały czułość nowych metod enzymatycznych równą klasycznym metodom hodowlanym (1 jtk/100 ml). Uzyskane wyniki potwierdziły również zdolność do wykrywania uszkodzonych komórek grupy coli w czasie do 24 godzin.

Metoda Colilert
    W oparciu o technologię DST został opracowany test komercyjny: Colilert (IDEXX Laboratories, Portland, ME, USA) z substratem chromogennym ONPG oraz fluorogennym MUG. Zostały przeprowadzone liczne i bardzo obszerne badania porównawcze pomiędzy tymi testami komercyjnymi i klasycznymi metodami NPL i FM dla różnych typów wód. Testy te były skuteczne do wykrywania pałeczek E. coli w wodach o różnym stopniu zanieczyszczenia i z różnym udziałem mikroflory towarzyszącej (tzw. tła). Udowodniono, że test Colilert jest tak czuły i specyficzny, że wykrywa jedną komórkę bakterii grupy coli w obecności tła na poziomie 106. W latach 90. została również opracowana ilościowa wersja testu Colilert z zastosowaniem specjalnych tacek Quanti-Tray (QT) (IDEXX), która jest uproszczoną i bardzo wygodną wersją NPL, pozwalającą na wykrycie i oznaczenie ilościowe bakterii grupy coli i E.coli bez konieczności wykonywania kolejnych 10-krotnych rozcieńczeń (fot. 1).

Fot. 1. Porównanie wyników analizy mikrobiologicznej wody zawierającej bakterie grupy coli, uzyskanych metodą referencyjną (FM) oraz metodą Colilert18

    Porównywano wyniki ilościowe dla próbek wody pitnej uzyskane metodą Colilert z wynikami dla referencyjnej metody filtracji membranowej (MF). Wszystkie opublikowane raporty dowiodły, że nie było znaczących różnic w oznaczaniu liczby bakterii E. coli, natomiast w przypadku ogólnej liczby bakterii grupy coli odnotowano większe wartości liczbowe dla metody Colilert w porównaniu z metodą FM.

Który korzystniejszy?
    Obecnie dostępne są testy Colilert w kilku wersjach: tradycyjny Colilert® wykrywający bakterie grupy coli i E. coli w czasie 24 godzin, nowszy Colilert-18® umożliwiający skrócenie czasu oczekiwania na wynik do 18 godzin oraz ColisureTM – test przeznaczony do analizy wód mętnych, zabarwionych. Przeprowadzono badania porównawcze testu Colisure i standardowych metod referencyjnych dla wykrywania bakterii w wodzie poddanej wcześniejszemu działaniu chloru. Wyniki tych badań wypadły zdecydowanie korzystniej dla testu Colisure, dla którego odnotowano większy odzysk w porównaniu ze standardowymi metodami, co skutkuje bardziej realistycznym oszacowaniem rzeczywistej populacji wykrywanych bakterii wskaźnikowych.
    Testy Colilert i Colisure stosowane są zarówno do wykrywania i ilościowego oznaczania bakterii z grupy coli i E. coli w różnych typach wód: od czystej wody pitnej, chlorowanej do bardzo zanieczyszczonych wód powierzchniowych. Metody te są łatwe w użyciu i dają szybsze i bardziej wiarygodne wyniki dla wskaźników sanitarnych niż metody klasyczne. To prawda, że metody enzymatyczne są droższe w zakresie materiałów eksploatacyjnych od klasycznych metod hodowlanych, gdy badane wody są czyste i nie wymagają dodatkowego badania potwierdzającego. Kiedy natomiast, w przypadku wód zanieczyszczonych, wymagane jest potwierdzenie kilku lub kilkunastu wyizolowanych kolonii, koszty poniesione w obu metodach są nawet niższe w przypadku metod enzymatycznych, które nie wymagają potwierdzenia.
    Wraz z wprowadzeniem technologii DST zmianie uległa definicja bakterii coli i E. coli. I tak bakterie grupy coli to takie, które metabolizują galaktopiranozyd orto-nitrofenylu przy użyciu enzymu β-galaktozydazy i produkują orto-nitrofenyl. Natomiast bakterie E. coli są zdolne do metabolizowania glukuronidu 4-metylo-umbelliferylu przy użyciu enzymu β-glukuronidazy i produkują 4-metylo-umbelliferon 
    Testy Colilert do wykrywania bakterii z grupy coli i E. coli, zatwierdzone przez U.S. Environmental Protection Agency (EPA) i opublikowane w Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater, stosowane są w prawie wszystkich laboratoriach państwowych w USA, a także w laboratoriach Kanady i Japonii oraz w Europie. Metoda DST i testy Colilert zostały zaakceptowane przez m.in. takie uznane międzynarodowe jednostki opiniotwórcze, jak: ASTM (American Society for Testing and Materials), AOAC (Association of Analytical Communities), IBWA (International Bottled Water Association), a w Europie rekomendują ją m.in. EBWA (European Bottled Watercooler Association) oraz Francuska Organizacja Normalizacyjna AFNOR, którą można uznać za reprezentatywną dla modelu prawodawstwa europejskiego.

* * *

    W Polsce testy Colilert posiadają atesty higieniczne Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego - Państwowego Zakładu Higieny. PZH kilkukrotnie wydał pozytywną opinię dotyczącą możliwości stosowania testów Colilert w rutynowych badaniach wody, uznając równoważność tej metody w stosunku do metod referencyjnych. Także Polskie Centrum Akredytacji (PCA) akredytowało w kilkudziesięciu laboratoriach metody Colilert w oparciu o dobre wyniki badań biegłości i sprawdzenie metod w warunkach danego laboratorium. Instytut Technologii Fermentacji i Mikrobiologii Politechniki Łódzkiej, jako pierwsza jednostka naukowo-dydaktyczna w kraju, włączył metody oparte o technologię DST do programu laboratorium mikrobiologicznego, by zapoznać studentów, przyszłych pracowników laboratoriów z metodyką coraz powszechniej stosowaną w akredytowanych laboratoriach badających wodę. Obecnie metody te stosowane są w około 140 laboratoriach stacji sanitarno-epidemiologicznych, inspektoratów ochrony środowiska, przedsiębiorstw wodociągowych, producentów wód butelkowanych, laboratoriach prywatnych, weterynaryjnych i wojskowych badających wodę, umożliwiając uzyskanie wiarygodnych wyników w krótkim czasie. Dobiega też końca procedura zgłoszenia przez Główny Inspektorat Sanitarny do Komisji Europejskiej faktu stosowania metod alternatywnych w naszym kraju, zgodnie z wymogiem art. 7 pkt. 5 Dyrektywy 98/83/WE, który brzmi: „Państwa członkowskie, które wykorzystały metody alternatywne, dostarczają Komisji wszelkich stosownych informacji dotyczących takich metod oraz ich równoważności”.

Autor: Dorota Kręgiel, Politechnika Łódzka

Artykuł został opublikowany w magazynie "Agro Przemysł" nr 3/2012

Źródło fot.: www.sxc.hu

Literatura:
1. Buckalew D.W., Hartman L.J., Grimsley G.A., Martin A.E., Register K.M. A long-term study comparing membrane filtration with Colilert defined substrates in detecting fecal coliforms and Escherichia coli in natural waters. J Environ Manage. 2006, 80(3):191-197.
2. Chrost, R.J., Microbial Enzymes in Aquatic Environments. Springer-Verlag, New York, 1991.
3. Clark, D.L., Milner, B.B., Stewart, M.H., Wolfe, R.L., Olson, B.H., Comparative study of commercial 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide preparations with the Standard Methods membrane filtration fecal coliforms test for the detection of Escherichia coli in water samples. Appl. Environ. Microbiol. 1991, 57, 1528– 1534.
4. De Roubin, M.R., Osswald, M.L., Bally, D., Cailas, M., Joret, J.C., Comparison of field and standardized techniques for the enumeration of total coliforms and Escherichia coli in water- Proceedings of AWWA-Water Quality Technology Conference, Denver, CO. American Water Works Association, 1997.
5. Eckner, K.F., Comparison of membrane filtration and multitube fermentation by the Colilert and enterolert methods for detection of waterborne coliform bacteria, Escherichia coli and enterococi used in drinking and bathing water quality in Southern Sweden. Appl. Environ. Microbiol. 1998, 64, 3079–3083.
6. Fricker, E.J., Fricker, C.R., Use of two presence/absence systems for the detection of E. coli and coliforms from water. Water Res. 1996, 30, 2226– 2228.
7. Fricker, E.J., Illingworth, K.S., Fricker, C.R., Use of two formulations of Colilert and Quantitray for assessment of the bacteriological quality of water. Water Res. 1997, 31, 2495–2499.
8. Kręgiel D. Problemy w mikrobiologicznej analizie wody – komórki żywe lecz nie dające się hodować. Przem. Spoż. 2005, 6, 32-41.
9. Kręgiel D. Wykrywanie komórek bakterii VBNC w środowisku wodnym. LAB 2005, 5, 6-45.
10. Manafi, M., Kneifel, W., Bascomb, S., Fluorogenic and chromogenic substrates used in bacterial diagnostics. Microbiol. Rev. 1991, 55, 335– 348.
11. McFeters, G.A., Broadaway, S.C., Pyle, B.H., Pickett, M., Egozy, Y., Comparative performance of Colisure. J. AWWA 1997, 89, 112– 120
12. Niemela S.I., Lee J.V., Fricker C.R. A comparison of the International Standards Organisation reference method for the detection of coliforms and Escherichia coli in water with a defined substrate procedure. J. Appl. Microbiol. 2003, 95, 1285–1292.
13. Noble R.T., Blackwood A.D., Griffith J.F., McGee C.D., Weisberg S.B. Comparison of Rapid Quantitative PCR-Based and Conventional Culture-Based Methods for Enumeration of Enterococcus spp. and Escherichia coli in Recreational Waters. Appl. Environ. Microbiol., 2010, 76, 7437–7443.
14. Olson, B.H., Clark, D.L., Milner, B.B., Stewart, M.H., Wolfe, R.L., Total coliform detection in drinking water: comparison of membrane filtration with Colilert and Coliquick. Appl. Environ. Microbiol. 1991, 57, 1535– 1539.
15. Talon P., Magajna B., Lofranco C., Leugn K.T. Microbial indicators of feacal contamination in water: a current perspective, Water Air Soil Poll. 2005, 166, 139-136.