Rys. 1. Dolna granica odczytu oraz krzywa standardowa w metodzie luminescencji.

Zjawisko bioluminescencji odkryte w 1947 roku przez McElroy’a wzbudza coraz większe zainteresowanie. W latach 60. pomiar adenozynotrifosforanu ATP metodą bioluminescencji został szerzej opisany przez naukowców NASA, którzy wykorzystali tę metodę do poszukiwania różnych form życia na innych planetach. Obecnie zjawisko bioluminescencji wykorzystuje się m.in. do monitoringu stanu higieny powierzchni produkcyjnych.

Bioluminescencja
    Większość organizmów wykazujących zjawisko bioluminescencji występuje w wodach morskich lub oceanicznych. Są to m.in.: ryby, pierwotniaki, meduzy, kałamarnice i rośliny morskie. Zdolność emisji światła wykazują także niektóre żuki (świetliki), grzyby, bakterie i owady. Emisja światła ma istotne znaczenie w życiu tych organizmów: służy do maskowania i ukrycia się przed drapieżnikami, pomaga w lepszym komunikowaniu się, lepszym widzeniu w ciemności lub przyciąganiu zdobyczy.
    Chemizm reakcji zachodzących w organizmach o zdolności bioluminescencji wykazuje pewne podobieństwo. W większości przypadków specyficzny substrat - lucyferyna (L) ulega utlenieniu w wyniku reakcji katalizowanej przez oksydazę zwaną lucyferazą (E). W wyniku oksydacji powstaje utleniona forma lucyferyny (E:LO*), którą charakteryzuje podwyższony stan energetyczny. Kompleks E:LO powraca do niższego stanu energetycznego, emitując energię w postaci światła (hν) oraz wydzielając inne produkty, np. CO2.

    Reakcja ATP z lucyferyną wymaga dla prawidłowego przebiegu odpowiednich parametrów fizycznych (pH, temperatura) oraz obecności ATP, jonów Mg+2 lub innych jonów metali na +2 stopniu utlenienia (Mn+2, Co+2, Fe+2, Ni+2 lub Zn+2). Luminescencja zachodzi w zakresie pH od 6,5 do 8,0, przy optimum wynoszącym 7,8÷7,9. Wartość temperatury optymalnej związana jest z działaniem enzymu i wynosi ok. 25°C. Energia fotonów oraz różnorodność substratów ma wpływ na częstotliwość (kolor) emitowanego światła. Np. ryby emitują zwykle światło niebieskie, meduzy - zielone, a świetliki - żółtozielone.

Luminometria
    Wielkość emisji światła powstającego w reakcji luminescencji mierzona jest za pomocą luminometru. Urządzenie to zawiera komorę pomiarową, detektor, układ przetwarzający sygnał optyczny na elektryczny i podający wynik w postaci umownych jednostek świetlnych RLU (ang. relative light unit). Komora pomiarowa luminometru zawiera kuwetę, mikropłytkę lub inny typ naczynia reakcyjnego. Musi być chroniona przed światłem zewnętrznym, by zminimalizować możliwe zakłócenia pomiaru oraz maksymalnie zbliżona do detektora w celu zwiększenia efektu optycznego, pozwalającego na szybki i precyzyjny pomiar.
    W technice luminometrii na ostateczny wynik pomiaru wpływają dwa składniki emisji światła oznaczanego przez detektor. Pierwszy składnik emisji jest proporcjonalny do stężenia oznaczanego reagenta, drugi składnik, zwany dolną granicą odczytu - daje stałą, minimalną emisję światła, której wielkość zależy od czystości zastosowanych reagentów i klasy luminometru (rys.1).
    Wielkość emisji światła jest wprost proporcjonalna do stężenia limitowanego reagenta. Np. w kompleksie ATP-lucyferyna-lucyferaza, gdy całkowita objętość mieszaniny reakcyjnej jest stała, a ATP jest reagentem limitowanym, emisja światła jest wprost proporcjonalna do stężenia ATP.

Tab. 1. Przykładowe wartości RLU dla różnych produktów rozcieńczonych 1:10 (wg danych firmy Merck dla luminometru HY-LiTE).

Luminometry – jak zmieniło się ich działanie?
    Początkowo luminometry do oceny czystości powierzchni były stacjonarnymi urządzeniami, a odczynniki niezbędne do prowadzenia reakcji bioluminescencji (25 - 50 testów) dostarczane były w postaci liofilizatów w butelkach lub fiolkach. Te pierwsze odczynniki miały bardzo krótki okres trwałości, gdyż w postaci uwodnionej mogły być przechowywane w lodówkach zaledwie przez kilka dni. Obecnie praktyczne zastosowanie mają mniejsze, przenośne luminometry, które umożliwiają wykonanie pomiarów na obszarze produkcyjnym, czyli poza laboratorium. Ponadto urządzenia te mają możliwość współpracy z komputerem. Oprogramowanie umożliwia identyfikację i rejestrację próbek oraz opracowanie wyników w arkuszach kalkulacyjnych łącznie z analizą trendu. W Polsce dostępnych jest kilkanaście typów luminometrów o różnym zastosowaniu w zakładach przemysłu spożywczego, np. Novalum, Firefly, Lumitester PD-20, SystemSure II, Systemsure Plus, Lightning MVP, HY-LiTE i in.
    Odczynniki niezbędne do reakcji bioluminescencji i ich opakowania również zostały ulepszone i obecnie są dostarczane dla użytkownika w wygodnej i funkcjonalnej postaci jednorazowych zestawów (tzw. „all in one”), gwarantującej stabilność reagentów oraz powtarzalność pomiarów. Zestawy przechowywane w lodówce wykazują trwałość przez 12 miesięcy lub mogą być przechowywane przez 6-8 tygodni w temperaturze +25oC bez znaczącej utraty aktywności i wydajności.
    Podstawą działania wszystkich systemów luminometrycznych stosowanych w monitoringu stanu higieny jest pomiar ilości adenozynotrifosforanu - ATP. Zawartość ATP w produktach spożywczych jest różna, na przykład w 1 g mięsa lub soku pomarańczowego występuje 10-7 g ATP, w tej samej ilości mleka 10-9 g ATP, a w lodach i piwie 10-8 g ATP (tab.1).
    ATP obecny jest także w komórkach drobnoustrojów. Jedna komórka bakteryjna zawiera przeciętnie jeden femtogram ft (10-15 g) ATP. Jego ilość zależy od stanu fizjologicznego i rodzaju mikroorganizmu. Bakterie gramdodatnie zawierają około 10 razy więcej ATP niż bakterie gramujemne, a spory bakteryjne nie zawierają go wcale. Komórki drożdżowe wykazują średnio około 100 razy więcej ATP niż komórki bakteryjne (tab.2).

Tab. 2. Zawartość ATP w komórkach różnych mikroorganizmów.

Monitoring higieny
    Największe praktyczne zastosowanie metoda bioluminescencji znalazła w kontroli stanu higienicznego powierzchni produkcyjnych, ocenie skuteczności procesów mycia i dezynfekcji oraz monitoringu w ramach systemu HACCP (Hazard Analysis Critical Control Point). System ten musi się opierać m.in. na skutecznym programie sanitarnym, na który składają się plany, procedury i podstawowe zabiegi udokumentowane w ramach programów dobrej praktyki produkcyjnej GMP (ang. Good Manufakturing Practice) oraz dobrej praktyki higienicznej GHP (ang. Good Hygiene Practice).
    Obecność ATP w próbkach pobranych do oceny stanu czystości w zakładzie wskazuje na istnienie różnych zanieczyszczeń organicznych (pozostałości roślinne, zwierzęce oraz mikroorganizmy). Określenie obecności nie tylko żywych drobnoustrojów, ale także innych substancji, będących doskonałą pożywką dla mikroorganizmów, stanowi o wyższości metody bioluminescencyjnej nad metodami referencyjnymi - hodowlanymi.

Rys. 2. Wpływ czynników zewnętrznych na wartość tła w pomiarze luminometrycznym.

    Istniejące tradycyjne, znormalizowane, hodowlane metody wykrywania oraz ilościowego oznaczania drobnoustrojów na powierzchniach produkcyjnych są czasochłonne i nie dają możliwości natychmiastowej oceny aktualnego stanu higieny w zakładzie. Zależnie od stosowanej pożywki wyniki uzyskuje się co najmniej po 24÷48 godzinnej inkubacji płytek/probówek, tj. w momencie, gdy instalacja lub urządzenie jest już włączone do procesu technologicznego. Ponadto rutynowa kontrola mikrobiologiczna oparta jest na okresowym, a nie ciągłym pobieraniu prób, tak więc obecność wielu drobnoustrojów, w tym także i patogenów, nie zawsze może zostać wykryta. Natomiast kontrola w systemie HACCP powinna odbywać się na bieżąco podczas procesu produkcji, co w przypadku zaobserwowania nieprawidłowości pozwala na podjęcie natychmiastowych działań korygujących.
    Największe praktyczne zastosowanie metoda bioluminescencji znalazła w kontroli stanu higienicznego powierzchni produkcyjnych, ocenie skuteczności procesów mycia i dezynfekcji oraz monitoringu w ramach systemu HACCP.

W myśl rozporządzenia 2073/2005 przedsiębiorstwa sektora spożywczego powinny mieć możliwość wykorzystywania innych metod analitycznych niż metody referencyjne.

Luminometria w przemyśle spożywczym
    W myśl rozporządzenia 2073/2005 przedsiębiorstwa sektora spożywczego powinny mieć możliwość wykorzystywania innych metod analitycznych niż metody referencyjne, szczególnie metod szybkich, o ile ich wykorzystanie daje równoważne wyniki. Luminometria jest właśnie jedną z takich metod alternatywnych, coraz powszechniej stosowaną w zakładach przemysłu spożywczego.
    Stosunkowo najwięcej badań poświęcono zastosowaniu luminometrii w przemyśle mleczarskim, mięsnym, w produkcji napojów, soków owocowych oraz piwa. Metoda ta została wykorzystana do badania czystości samochodów transportujących żywność, np. cystern do przewożenia mleka oraz do kontroli czystości opakowań szklanych i efektywności ich mycia. Luminometrię wykorzystano także do oceny mikrobiologicznego zanieczyszczenia plastikowych opakowań do żywności. Może ona również znaleźć praktyczne zastosowanie do określania zdolności drobnoustrojów do adhezji i tworzenia biofilmów. Ma to istotne znaczenie dla przemysłu spożywczego, gdyż mikroorganizmy o własnościach adhezyjnych wykazują zwykle większą oporność na środki dezynfekcyjne.
    Do oceny wyznaczonych punktów pomiarowych metodą luminometrii otrzymane wyniki porównuje się z wartościami progowymi, uprzednio wyznaczonymi dla danej branży, zakładu i poszczególnych miejsc pomiarowych. Dla każdego punktu pomiarowego należy ustalić tzw. „tło oznaczenia”, czyli dopuszczalny poziom RLU, który wynika z rodzaju surowca, technologii jego przetworzenia, rodzaju powierzchni urządzenia i aparatury oraz materiału, z jakiego zostały wykonane (rys. 2). Niski poziom RLU wskazuje, że punkt pomiarowy jest czysty, wolny od zanieczyszczeń organicznych i mikrobiologicznych („pass” - dobrze), natomiast gdy poziom RLU jest wysoki, to punkt należy uznać jako zanieczyszczony substancjami organicznymi („fail” - źle). Wartości tła, tzw. „pass”, ustala się po czyszczeniu i myciu punktu krytycznego. Maksymalny dopuszczalny poziom zanieczyszczenia określa 3-krotną wartość „pass”, czyli „fail”. Wszystkie uzyskane wartości powyżej „fail” świadczą o złym stanie sanitarnym badanego punktu oraz o źle przeprowadzonym procesie mycia. Wskazują tym samym na konieczność powtórzenia procedur. Wartości RLU pomiędzy poziomem „fail” i „pass” określają stan sanitarny możliwy do zaakceptowania. Stan sanitarny można przyjąć bez zastrzeżeń wtedy, gdy wartości RLU znajdują się poniżej poziomu „pass”. Przykładowe wartości poziomu „fail” i „pass” wyrażone w RLU dla wybranych branż przemysłu spożywczego przedstawia tabela 3.

Tab. 3. Przykładowe graniczne poziomy wartości „pass” i „fail” wyrażone w RLU dla wybranych branży przemysłu spożywczego (wg danych firmy Merck).

    Wprowadzenie luminometrii, jako szybkiej metody analitycznej do monitorowania stanu higienicznego powierzchni produkcyjnych, jest uzależnione m.in. od ceny oraz możliwości jej zastosowania w konkretnych warunkach produkcyjnych. Należy jednak pamiętać, że stosowanie luminometrii w takiej rutynowej kontroli wymaga walidacji w odniesieniu do referencyjnych metod hodowlanych.

Autor: dr inż. Dorota Kręgiel, Politechnika Łódzka

 Artykuł został opublikowany w magazynie "Agro Przemysł" nr 1/2012